Системин е добре познат растителен пептиден хормон, който играе решаваща роля в защитния отговор на растението срещу тревопасни животни и патогени. Като водещ доставчик на Systemin, разбирането как да се открие Systemin в растенията е от изключителна важност не само за научни изследвания, но и за гарантиране на качеството и автентичността на продуктите Systemin, които предлагаме. В този блог ще изследваме различни методи за откриване на Systemin в растения, като се задълбочаваме в научните принципи зад всеки подход.
1. Имунологични методи за откриване
Техниките за имунологично откриване се използват широко за откриване на Systemin в растения поради тяхната висока специфичност и чувствителност. Тези методи разчитат на използването на антитела, които специфично разпознават и се свързват със Systemin.
Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)
ELISA е често използван имунологичен метод. Това включва покриване на микроплака с антитяло, специфично за Systemin. След това към ямките на микроплаката се добавят растителни екстракти. Ако Systemin присъства в екстракта, той ще се свърже с имобилизираното антитяло. Впоследствие се добавя второ антитяло, конюгирано с ензим. Това вторично антитяло също се свързва със Systemin. След отмиване на всички несвързани вещества се добавя субстрат за ензима. Реакцията ензим - субстрат произвежда откриваем сигнал, често промяна на цвета, който може да бъде измерен фотометрично. Интензитетът на сигнала е пропорционален на количеството Systemin в пробата.
Предимствата на ELISA включват неговата висока чувствителност, възможност за обработка на множество проби едновременно и относителна лекота на използване. Въпреки това, това изисква производството на висококачествени антитела и кръстосаната реактивност с други пептиди в растителния екстракт понякога може да бъде проблем.
Western blotting
Western blotting е друга мощна имунологична техника. Първо, растителните протеини се екстрахират и разделят чрез гел електрофореза въз основа на тяхното молекулно тегло. След това отделените протеини се прехвърлят върху мембрана. Антитяло, специфично за Systemin, се инкубира с мембраната. След промиване се добавя вторично антитяло, конюгирано с реагент за откриване (като флуоресцентен или хемилуминесцентен маркер). Наличието на Systemin се визуализира като отделна лента върху мембраната.
Western blotting дава възможност за определяне на молекулното тегло на Systemin и може да предостави информация за възможните му модификации. Той обаче отнема повече време и изисква повече технически усилия в сравнение с ELISA.
2. Масова спектрометрия - базирано откриване
Масспектрометрията (MS) е много точен и универсален метод за откриване на Systemin в растения. Той може да идентифицира и количествено определи пептидите въз основа на съотношението им маса-към-заряд (m/z).
Течна хроматография - Масспектрометрия (LC - MS)
В LC - MS, растителните екстракти първо се разделят чрез течна хроматография. След това отделените компоненти се въвеждат в масспектрометър. Масспектрометърът йонизира молекулите и измерва техните m/z стойности. Чрез сравняване на получените m/z стойности с теоретичните m/z на Systemin може да се потвърди наличието на Systemin.
LC - MS предлага висока резолюция и възможност за откриване на Systemin дори в сложни растителни матрици. Може също така да предостави информация за структурата и възможните посттранслационни модификации на Systemin. Това обаче изисква скъпо оборудване и висококвалифициран персонал.
Тандемна масспектрометрия (MS/MS)
MS/MS е разширение на масспектрометрията. След първоначалния масов анализ в първия масспектрометър избраните йони се фрагментират и фрагментите се анализират във втори масспектрометър. Това позволява определянето на аминокиселинната последователност на Systemin, което е от съществено значение за потвърждаване на неговата идентичност.
MS/MS е особено полезен, когато се работи с проби, където може да има изобарни или изомерни пептиди, които биха могли да попречат на идентифицирането. Той предоставя подробна структурна информация за Systemin, но също така е по-сложен и отнема време от едноетапната масспектрометрия.
3. Молекулярна биология - базирано на откриване
Техниките на молекулярната биология също могат да се използват за откриване на Systemin на ниво генна експресия.
Обратна транскрипция - полимеразна верижна реакция (RT - PCR)
RT - PCR се използва за откриване на иРНК, кодираща Systemin. Първо, общата РНК се извлича от растителните тъкани. След това тРНК се реверсира - транскрибира в комплементарна ДНК (кДНК) с помощта на обратна транскриптаза. Специфични праймери за гена Systemin се използват за амплифициране на cDNA чрез PCR. Амплифицираните ДНК фрагменти могат да бъдат визуализирани чрез гел електрофореза.
RT - PCR позволява откриване на експресия на ген Systemin, което може да покаже физиологичното състояние на растението по отношение на неговия защитен отговор. Въпреки това, той само предоставя информация за потенциалното производство на Systemin на транскрипционно ниво и не измерва директно присъствието на самия пептид.
Количествен PCR в реално време (qRT - PCR)
qRT - PCR е по-усъвършенствана версия на RT - PCR. Позволява количествено определяне на количеството мРНК Systemin в пробата. По време на PCR реакцията се използва флуоресцентно багрило или флуоресцентно маркирана сонда за наблюдение на амплификацията в реално време. Цикълът, при който флуоресцентният сигнал преминава праг (Ct стойност) е обратно пропорционален на количеството на целевата иРНК.
qRT - PCR осигурява по-точно количествено определяне на експресията на ген Systemin в сравнение с традиционната RT - PCR. Полезен е за изучаване на регулирането на производството на Systemin в отговор на различни стимули.
4. Биоанализ - откриване на базата
Биотестовете разчитат на биологичната активност на Systemin, за да открият присъствието му. Например, известно е, че Systemin индуцира синтеза на протеазни инхибитори в растенията. Биоанализ може да бъде настроен чрез третиране на растителни тъкани с проба, за която се подозира, че съдържа Systemin и след това измерване на индукцията на протеазни инхибитори.
Предимството на биотестовете е, че те директно измерват биологичната активност на Systemin. Въпреки това, те са по-малко специфични в сравнение с други методи и могат да бъдат повлияни от други фактори в растителния екстракт, които също могат да повлияят на синтеза на протеазен инхибитор.
Заключение
Като доставчик на Systemin, ние разбираме значението на точното и надеждно откриване на Systemin. Всеки от описаните по-горе методи има своите предимства и ограничения. Имунологичните методи са силно специфични и чувствителни, масспектрометрията предоставя подробна структурна информация, техниките на молекулярната биология предлагат прозрения за генната експресия, а биотестовете измерват биологичната активност. На практика може да се използва комбинация от тези методи, за да се гарантира точното откриване и количествено определяне на Systemin в растенията.
Ако се интересувате от закупуване на висококачествен Systemin за вашите изследвания или други приложения, ви каним да се свържете с нас за допълнителни дискусии. Ние се ангажираме да ви предоставим най-добрите продукти и услуги. Може да се интересувате и от някои от другите ни пептидни продукти, като напрФрагмент на гликопротеин IIb (296 - 306),PHM - 27 (човек), исекретин (плъх).
Референции
- Райън, Калифорния (2000). Системният сигнален път: диференциално активиране на растителни защитни гени. Biochimie, 82 (10 - 11), 847 - 853.
- Schilmiller, AL, & Howe, GA (2005). Системин: полипептиден сигнал за защитни реакции на растенията. Current Biology, 15 (18), R744 - R747.
- van der Hoorn, RA, & Jones, JD (2004). Протеази в защитата на патогените. Current Opinion in Plant Biology, 7(4), 400 - 406.