Какво е пептиден синтез

 

Пептидният синтез е активно поле в химията на протеините и пептидите, което обикновено включва последователно добавяне на аминокиселини в определен ред за образуване на пептидната верига чрез химични методи. Основните методи за синтез са течнофазов и твърдофазов синтез. В сравнение с LPPS, SPPS има предимствата да бъде по-бърз, по-прост, с по-малко странични реакции и по-високи добиви.

 

Стандартен SPPS метод, включващ Boc (бензил) и Fmoc (tBu) стратегии.

 

 

Boc (бензил) стратегия

В този подход на синтез, хлорометилиран, хидроксиметилиран полистирен и р-метоксибензил (PMA) смоли се използват като твърди подложки. -Аминогрупата е защитена с t-бутоксикарбонил (Вос), докато групите на страничната верига на аминокиселините са защитени с бензилови производни. Boc групата се отстранява с помощта на чист TFA или TFA в CH2Cl2 и в края на синтеза защитните групи на страничната верига и връзките пептид-смола се отстраняват със силна киселина като безводна флуороводородна киселина (HF) или TFMSA.

 

Fmoc (tBu) стратегия

При този подход на синтез Wang-смола, 2-хлоротритил хлоридна смола, Rink амид-AM смола, Rink амид-MBHA смоли се използват като твърди подложки. -Амино групата е защитена с 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc ), докато странични верижни групи от аминокиселини са защитени с киселинно-лабилни защитни групи. Fmoc групата се отстранява с помощта на 20% пиперидин в DMF и в края на синтеза, защитните групи на страничната верига и връзките пептид-смола се отстраняват с 1%-95% TFA. Fmoc SPPS в момента е предпочитаният метод за пептиден синтез.

 

Основни принципи на Fmoc твърдофазов пептиден синтез

 

Изберете смола

Най-широко прилаганите смоли във Fmoc SPPS, включително 4-алкоксибензилова алкохолна (Wang) смола, 2-хлоротритил хлоридна смола, Rink Amide Resin, Rink Amide-MBHA смоли. Амидните смоли се използват за синтез на пептиди с необходимо амидиране на С край. Смолата Wang и 2-Cl Trt смолата обикновено се използват за синтез на пептид с необходим свободен от C терминал COOH. Но когато С-краят на пептида има Pro и Gly като първа аминокиселина, смолата Wang не трябва да се използва поради риск от образуване на DKP (дикетопиперазин), 2-хлоротритил хлоридната смола се препоръчва за употреба.

 

 

Прикрепване на защитени аминокиселини към смоли

Първата Fmoc аминокиселина е прикрепена към неразтворима поддържаща смола чрез киселинно лабилен линкер.

 

Премахване на защитата на -амино защитната група

Временната Fmoc защитна група в N-края на пептидил-смолата се отстранява чрез третиране с разтвор на 20% пиперидин в DMF. Тази реакция обикновено завършва в рамките на 10 до 20 минути.

 

Стъпки за измиване

След всяка химическа реакция се извършват стъпки на измиване, за да се отстранят излишните реагенти, странични продукти и нереагирали молекули от смолата. Това помага да се поддържа чистотата на растящата пептидна верига.

 

Активиране и свързване на защитената аминокиселина

Защитената аминокиселина, свързана със смолата, се активира, за да подобри нейната реактивност за свързване със следващата аминокиселина в последователността. Обичайните активиращи агенти включват HOAt, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU и HATU. Свързването включва образуване на пептидна връзка между активираната аминокиселина и аминогрупата на нарастващата пептидна верига. Тестът на Кайзер обикновено се използва за наблюдение на пълнотата на реакциите на свързване.

 

Стъпки за измиване

Подобно на по-ранните етапи на промиване, това гарантира отстраняването на излишните реагенти и странични продукти след реакцията на свързване.

 

Отцепване от смолата и премахване на защитата на защитните групи на страничната верига

След като желаната пептидна последователност се синтезира върху смолата, тя се отцепва от твърдата подложка, като се използва смес за разцепване като трифлуорооцетна киселина (TFA), съдържаща акцептори като тиоанизол и вода. Едновременно с това защитните групи на страничната верига на аминокиселинните остатъци се отстраняват, разкривайки напълно депротектирания пептид, готов за пречистване и анализ.