Ей там! Аз съм доставчик на Tet - 213 клетки и днес ще ви преведа как да извършите имунофлуоресценция оцветяване на тези клетки. Имунофлуоресцентното оцветяване е супер полезна техника в света на клетъчната биология. Той ни помага да визуализираме специфични протеини в клетките, като ни дава по -добро разбиране на техните функции и местоположения.
Подготовка на Tet - 213 клетки
Първо, първо, трябва да подготвим нашите Tet - 213 клетки. Започнете, като ги отглеждате в подходяща културална среда. Тези клетки обикновено се справят добре в среда като RPMI 1640, допълнен с 10% фетален говежди серум (FBS) и 1% пеницилин - стрептомицин. Инкубирайте клетките при 37 ° С в 5% атмосфера на CO₂.
След като клетките достигнат около 70 - 80% сливане, е време да започнете процеса на оцветяване. Ще трябва да засявате клетките върху покривки в плоча с 24 - кладенеца. Това улеснява обработката на клетките по време на стъпките на оцветяване. Използвайте пипета, за да прехвърлите внимателно суспензията на клетката върху покривалото. Уверете се, че разпределяте клетките равномерно.
Фиксиране на клетките
След като клетките са се прикрепили към покривалото (обикновено след 24 часа), е време да ги поправите. Фиксирането е от решаващо значение, тъй като запазва клетъчната структура и поддържа протеините на място. Можете да използвате фиксатор като 4% параформалдехид (PFA) във фосфат - буфериран физиологичен разтвор (PBS). Добавете достатъчно PFA, за да покриете клетките на покривалото и го оставете да седи на стайна температура за около 15 - 20 минути.
След като фиксацията е направена, измийте клетките три пъти с PBS. Всяко измиване трябва да продължи около 5 минути. Това помага да се премахне излишният фиксатор от клетките.
Пермеабилизация
След това е пермеабилизация. Тази стъпка позволява на антителата да влизат в клетките и да се свързват с целевите протеини. Използвайте пермеабилизиращ агент като 0,1% Triton x - 100 в PBS. Добавете пермеабилизиращия разтвор към клетките и го оставете да се инкубира при стайна температура за около 10 минути.
След това измийте клетките три пъти с PBS отново, точно както в предишната стъпка. Това гарантира, че пермеабилизиращият агент е напълно отстранен.
Блокиране
Блокирането е важна стъпка за предотвратяване на не -специфично свързване на антителата. Можете да използвате блокиращ разтвор като 5% говежди серумен албумин (BSA) в PBS. Добавете блокиращия разтвор към клетките и го оставете да се инкубира при стайна температура за около 1 час.
Първична инкубация на антитела
Сега е време да добавите основното антитяло. Основното антитяло е специфично за протеина, който искате да откриете в Tet - 213 клетки. Разредете първичното антитяло в блокиращия разтвор според инструкциите на производителя.
Внимателно отстранете блокиращия разтвор от клетките и добавете разреденото първично антитяло. Не забравяйте да покриете клетките напълно с разтвора на антителата. Инкубирайте клетките с първичното антитяло за една нощ при 4 ° С. Това дълго време на инкубация позволява на антитялото да се свързва ефективно с целевия протеин.
На следващия ден измийте клетките три пъти с PBS, като всяко измиване продължава около 5 минути. Това се отърва от всяко несвързано първично антитяло.
Вторично инкубация на антитела
След първичното инкубация на антитела е време за вторичното антитяло. Вторичното антитяло е белязано с флуоресцентно багрило, което ни позволява да визуализираме целевия протеин под флуоресцентен микроскоп.
Разредете вторичното антитяло в блокиращия разтвор според инструкциите на производителя. Извадете PBS от клетките и добавете разреденото вторично антитяло. Инкубирайте клетките при стайна температура за около 1 - 2 часа на тъмно. Тъмната среда е важна, за да се предотврати избледняването на флуоресцентното багрило.
След като инкубацията приключи, измийте клетките три пъти с PBS, точно както преди.
Контрастиране
Противопоставянето се използва за визуализиране на клетъчните ядра. Можете да използвате багрило като DAPI (4 ', 6 - Diamidino - 2 - Fenylindole). Разредете DAPI в PBS и го добавете към клетките. Оставете го да се инкубира при стайна температура за около 5 минути.
След това измийте клетките още веднъж с PBS, за да премахнете излишния DAPI.
Монтаж
И накрая, време е да монтирате покривалото върху микроскопските слайдове. Използвайте монтажна среда, която помага да се запазят клетките на място и също така запазва флуоресценцията. Внимателно поставете капка монтажна среда върху плъзгач на микроскоп и след това обърнете покривалото върху капката. Уверете се, че няма въздушни мехурчета, хванати в капан между покривалото и слайда.
Изображения
Сега сте готови да представите клетките под флуоресцентен микроскоп. Използвайте съответните филтри, за да визуализирате флуоресцентните сигнали от вторичното антитяло и DAPI. Можете да направите множество изображения в различни зрителни полета, за да получите добро представяне на клетките.
Използване на свързани пептиди в процеса
По време на процеса на клетъчна култура и оцветяване може да намерите и някои пептиди полезни. Например,(Gly14) -humanin (човек)Доказано е, че има някакво благоприятно въздействие върху жизнеспособността и функцията на клетките. Можете да го добавите към културната среда, за да видите дали тя влияе на протеиновата експресия, която изучавате в Tet - 213 клетки.
Фибронектин CS1 пептидМоже да се използва за покриване на покривалото преди засяване на клетките. Това може да подобри привързаността и разпространението на клетките, което прави процеса на оцветяване по -ефективен.
Ендотелин - 1 (11 - 21)Може също да играе роля в сигналните пътища в клетките Tet - 213. Можете да го добавите към културната среда и след това да проучите как влияе върху експресията на целевия протеин чрез оцветяване на имунофлуоресценция.
Заключение
Извършването на имунофлуоресценция оцветяване на Tet - 213 клетки може да бъде малко сложен процес, но ако следвате внимателно тези стъпки, трябва да можете да получите някои страхотни резултати. Това е мощна техника, която може да ви даде ценна представа за биологията на тези клетки.
Ако се интересувате от закупуване на Tet - 213 клетки или някое от свързаните с пептиди, споменати в този блог, не се колебайте да се свържете с нас за повече информация и да започнете дискусия за обществени поръчки. Тук сме, за да ви помогнем с всички ваши нужди от клетъчна биология.
ЛИТЕРАТУРА
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Молекулярна биология на клетката. Garland Science.
- Pollard, TD, & Earnshaw, WC (2004). Клетъчна биология. Сондърс.