В сферата на пептидните изследвания и развитие чистотата на каталожните пептиди е от изключително значение. Като специализиран доставчик на каталог пептиди, ние разбираме значението на предоставянето на висококачествени продукти на нашите клиенти. Понякога, въпреки най -добрите ни усилия в първоначалните процеси на синтез и пречистване, може да има нужда от по -нататъшно пречистване на каталожните пептиди. В този блог ще изследваме различни методи и съображения за по -нататъшно пречистване на каталожните пептиди, когато е необходимо.
Защо по -нататъшно пречистване?
Има няколко причини, поради които може да е необходимо по -нататъшно пречистване на каталожните пептиди. Първо, при силно чувствителни изследователски приложения като тестове, базирани на клетки, in vivo проучвания или структурни изследвания по биология, дори количеството на примесите могат да окажат значително влияние върху експерименталните резултати. Примесите потенциално биха могли да попречат на биологичната активност на пептида, което води до фалшиви позитиви или негативи.
Второ, регулаторните изисквания в някои индустрии, като фармацевтичните продукти, изискват много високо ниво на чистота за пептиди, използвани при развитието на лекарствата. Ако пептидът се счита за потенциален терапевтичен агент, всякакви примеси могат да представляват риск за безопасността на пациента и по този начин са от съществено значение допълнителни етапи на пречистване.
Хроматографски методи
Обратна - Фазова течна хроматография с висока производителност (RP - HPLC)
RP - HPLC е един от най -широко използваните методи за пречистване на пептиди. Той разделя пептидите въз основа на тяхната хидрофобност. Стационарната фаза в RP - HPLC е хидрофобна материал, обикновено колона на базата на силициев диоксид с прикрепени алкилови вериги (напр. C18 или C8). Пептидите с различен хидрофобност ще взаимодействат по различен начин със стационарната фаза, което води до различни времена на задържане.
За по -нататъшно пречистване на каталожните пептиди с помощта на RP - HPLC, първо трябва да изберем подходяща мобилна фаза. Обща подвижна фаза се състои от смес от вода и органичен разтворител като ацетонитрил или метанол, с добавяне на малко количество киселина (напр. Трифлуороцетна киселина, TFA) за подобряване на върховата форма. Чрез регулиране на градиента на органичния разтворител можем да оптимизираме отделянето на целевия пептид от примесите.
Например, ако имаме каталог пептид катоLL-37, антимикробен пептид, който е антимикробен пептид с потенциални терапевтични приложения, RP - HPLC може да се използва за премахване на всички останали синтеза чрез - продукти или разградени фрагменти. След това пречистената LL - 37 може да се използва в по -точни тестове за антимикробна активност.
Йон - обменна хроматография
Йон - обменната хроматография разделя пептидите въз основа на техния заряд. Има два основни типа: катион - обменна хроматография (CEX) и анион - обменна хроматография (AEX). В CEX стационарната фаза има отрицателно заредена група и пептидите с нетен положителен заряд ще се свържат с нея. В AEX стационарната фаза се зарежда положително и ще бъдат запазени отрицателно заредени пептиди.
Изборът между CEX и AEX зависи от изоелектричната точка (PI) на пептида. Ако PI на пептида е под рН на подвижната фаза, пептидът ще има нетен отрицателен заряд и AEX може да се използва. И обратно, ако PI е над рН на подвижната фаза, CEX е по -подходящ.
Например,Ureistachykinin II, пептид със специфичен профил на заряд, може да бъде допълнително пречистен с помощта на йонна обменна хроматография. Чрез внимателно подбор на pH на подвижната фаза и йонната сила можем да постигнем добро отделяне на целевия пептид от други заредени примеси.
Електрофоретични методи
Натриев додецил сулфат - полиакриламиден гел електрофореза (SDS - Page)
Въпреки че SDS - PAGE се използва главно за протеинов анализ, тя може да се приложи и за пречистване на пептиди до известна степен. В SDS - PAGE пептидите се денатурират от SDS и се разделят въз основа на тяхното молекулно тегло. Пептидите мигрират през полиакриламиден гел под въздействието на електрическо поле.
След електрофореза гелът може да бъде оцветен за визуализиране на пептидите. След това лентата, съответстваща на целевия пептид, може да бъде изрязана от гела и пептидът може да бъде елуиран от гел матрицата. Този метод обаче има някои ограничения. Процесът на елуиране може да бъде сложен и може да има известна загуба на пептид по време на пречистването. Също така, SDS може да бъде трудно да се отстрани напълно от пречистения пептид.
Капилярна електрофореза (CE)
Капилярната електрофореза е мощна техника за разделяне на пептидите. Той предлага висока ефективност на разделяне, кратко време за анализ и ниска консумация на проби. CE разделя пептидите въз основа на съотношението им за зареждане - към - масата. Има различни режими на СЕ, като електрофореза на капилярната зона (CZE), електрофореза на капилярния гел (CGE) и мицеларна електрокинетична хроматография (MEKC).
CZE е най -често използваният режим за анализ и пречистване на пептиди. При Cze пептидите се разделят в буфер - пълна капиляр под електрическо поле. Разделянето се основава на разликите в електрофоретичната подвижност на пептидите. CE може да бъде съчетан с различни методи за откриване, като UV абсорбция, флуоресценция и масспектрометрия, за да се подобри точността на идентифицирането и пречистването на пептида.
Други съображения
Разтворимост
Разтворимостта на пептида е важен фактор в процеса на пречистване. Ако пептидът има лоша разтворимост в разтворителите за пречистване, това може да доведе до утаяване по време на пречистването, което ще повлияе на възстановяването и чистотата на пептида. За да подобрим разтворимостта на пептидите, можем да коригираме pH на разтворителя, да добавим CO - разтворители или да използваме специфични разтворителни средства.
Анализ на чистотата
След по -нататъшно пречистване е от съществено значение да се анализира чистотата на пептида. Общите методи за анализ на чистота включват течна хроматография с висока производителност (HPLC), масспектрометрия (MS) и ядрен магнитен резонанс (NMR). HPLC може да предостави информация за хроматографската чистота на пептида, докато МС може да потвърди молекулното тегло на пептида и да открие всякакви примеси с различни маси. ЯМР може да се използва за определяне на структурата и чистотата на пептида на атомно ниво.
Заключение
Като доставчик на каталог пептиди, ние се ангажираме да предоставяме висококачествени пептиди на нашите клиенти. Когато е необходимо по -нататъшно пречистване на каталожните пептиди, ние имаме различни методи на наше разположение, включително хроматографски методи, електрофоретични методи и други съображения като разтворимост и анализ на чистотата. Чрез внимателно избор на подходящия метод за пречистване и оптимизиране на условията за пречистване, можем да гарантираме, че пептидите отговарят на изискванията с висока чистота на нашите клиенти.
Ако имате някакви нужди от каталожни пептиди или се нуждаете от допълнителни услуги за пречистване, не се колебайте да се свържете с нас за поръчки и дискусии. Очакваме с нетърпение да работим с вас, за да посрещнем вашите пептидни изследвания и нужди за развитие.
ЛИТЕРАТУРА
- Snyder, LR, Kirkland, JJ, & Dolan, JW (2010). Въведение в съвременната течна хроматография. Уайли.
- Jorgenson, JW, & Lukacs, KD (1981). Електрофореза на капилярната зона. Аналитична химия, 53 (8), 1298 - 1302.
- Laemmli, UK (1970). Разцепване на структурни протеини по време на сглобяването на главата на бактериофага Т4. Природа, 227 (5259), 680 - 685.