Трансфекцията е решаваща техника в молекулярната биология, която позволява въвеждането на чужди нуклеинови киселини в клетки, което позволява на изследователите да изследват генната функция, експресията на протеини и клетъчните сигнални пътища. Tet-213 клетките, човешка невробластома клетъчна линия, обикновено се използват в изследванията на невронауката поради техните невронални свойства. В тази публикация в блога ще споделя някои прозрения за това как да трансфектирам ефективно Tet-213 клетки, като се опирам на моя опит като доставчик на клетки Tet-213.
Разбиране на Tet-213 клетки
Преди да се задълбочи в процеса на трансфекция, е важно да се разберат характеристиките на клетките Tet-213. Тези клетки са получени от човешки невробластом и проявяват невронални характеристики, като способността за разширяване на невритите и експресиране на невронални маркери. Те са прилепнали клетки, които растат добре при стандартни условия на клетъчната култура, обикновено в среда, допълнена с фетален говежди серум (FBS) и антибиотици.
Избор на правилния метод на трансфекция
Налични са няколко метода за трансфектиране на клетките, всеки със собствени предимства и ограничения. Изборът на метод на трансфекция зависи от различни фактори, включително вида на нуклеиновата киселина, която ще бъде трансфектирана, типа на клетката и желаната ефективност на трансфекцията. Ето някои често срещани методи за трансфекция, подходящи за Tet-213 клетки:
Трансфекция на базата на липиди
Трансфекцията на базата на липиди е един от най-широко използваните методи за въвеждане на нуклеинови киселини в клетките. Тя включва използването на липидни реагенти, които образуват комплекси с нуклеиновата киселина, които след това се поемат от клетките чрез ендоцитоза. Трансфекцията на базата на липиди е сравнително лесна за изпълнение и може да постигне висока ефективност на трансфекция в много типове клетки, включително клетки Tet-213.
Електропорация
Електропорацията е физически метод, който използва електрическо поле за създаване на временни пори в клетъчната мембрана, което позволява на нуклеиновата киселина да влезе в клетките. Този метод е особено полезен за трансфектиране на клетки, които са трудни за трансфектиране, използвайки други методи, като първични клетки. Електропорацията обаче може да бъде по -вредна за клетките и може да изисква оптимизиране на параметрите на електропорацията, за да се постигне висока ефективност на трансфекция.
Вирусна трансдукция
Вирусната трансдукция включва използването на вирусни вектори за доставяне на нуклеиновата киселина в клетките. Вирусните вектори са получени от вируси, които са проектирани за пренасяне на желаната нуклеинова киселина и могат ефективно да заразят клетките. Вирусната трансдукция може да постигне висока ефективност на трансфекция и може да се използва за трансфектиране на широк спектър от типове клетки, включително Tet-213 клетки. Въпреки това, вирусната трансдукция изисква специализирано оборудване и експертиза и има потенциални опасения за безопасност, свързани с използването на вирусни вектори.
Подготовка на клетките за трансфекция
Правилната подготовка на клетките е от съществено значение за успешната трансфекция. Ето няколко стъпки, които трябва да следвате при приготвяне на Tet-213 клетки за трансфекция:
Клетъчна култура
Поддържайте Tet-213 клетките в подходяща среда за клетъчна култура, допълнена с FBS и антибиотици. Преминаване на клетките редовно, за да поддържат тяхната експоненциална фаза на растеж. Важно е да използвате здрави, активно растящи клетки за трансфекция, тъй като клетките в лошо физиологично състояние могат да имат по -ниска ефективност на трансфекцията.
Клетъчно засяване
Заместете клетките Tet-213 в културна ястие или многоядрена плоча с подходяща плътност. Плътността на засяването зависи от метода на трансфекция и вида на експеримента. За трансфекцията на базата на липиди обикновено се препоръчва плътност на засяването 50-80% сливане.
Клетъчна инкубация
Инкубирайте заселените клетки във влажен инкубатор при 37 ° С с 5% CO2 за най -малко 24 часа преди трансфекцията, за да може клетките да се прикрепят и да се възстановят от процеса на засяване.
Извършване на трансфекцията
След като клетките се приготвят, е време да извършите трансфекцията. Ето общ протокол за трансфекция на базата на липиди на Tet-213 клетки:
Подгответе трансфекционния реагент
Следвайте инструкциите на производителя, за да подготвите реагента на трансфекцията на базата на липиди. Обикновено това включва разреждане на реагента в подходяща трансфекционна среда.
Пригответе нуклеиновата киселина
Пригответе нуклеиновата киселина, която трябва да се трансфектира, като плазмидна ДНК или siRNA. Разредете нуклеиновата киселина в подходяща трансфекционна среда.
Образуват трансфекционния комплекс
Смесете разредения трансфекционен реагент и разредената нуклеинова киселина в епруветка и инкубирайте при стайна температура в продължение на 15-30 минути, за да позволите образуването на трансфекционния комплекс.
Добавете трансфекционния комплекс към клетките
Извадете културната среда от клетките и я заменете със свежа трансфекционна среда. Добавете трансфекционния комплекс към клетките и леко завъртете плаката, за да разпределите равномерно комплекса.
Инкубирайте клетките
Инкубирайте трансфектираните клетки във влажен инкубатор при 37 ° С с 5% CO2 за подходящото време, в зависимост от вида на нуклеиновата киселина и експеримента. За плазмидна ДНК трансфекция, времето на инкубация от 24-48 часа обикновено е достатъчно, за да позволи генна експресия.
Оценка на ефективността на трансфекцията
След трансфекцията е важно да се оцени ефективността на трансфекцията, за да се определи дали трансфекцията е била успешна. Налични са няколко метода за оценка на ефективността на трансфекцията, включително:
Флуоресцентна микроскопия
Ако трансфектираната нуклеинова киселина кодира флуоресцентен протеин, като GFP, флуоресцентна микроскопия може да се използва за визуализиране на трансфектираните клетки. Процентът на флуоресцентни клетки може да се използва като оценка на ефективността на трансфекцията.
Проточна цитометрия
Проточната цитометрия може да се използва за количествено определяне на процента на трансфектирани клетки въз основа на експресията на флуоресцентен маркер или антиген на клетъчната повърхност. Този метод осигурява по -точна и количествена мярка за ефективност на трансфекцията в сравнение с флуоресцентната микроскопия.
Western blot или qpcr
Ако трансфектираната нуклеинова киселина кодира интерес от интерес, Western blot или qPCR може да се използва за откриване на експресията на протеина съответно на ниво протеин или мРНК. Този метод може да предостави информация за нивото на генната експресия и функционалността на трансфектирания протеин.
Отстраняване на проблеми с често срещаните проблеми с трансфекцията
Трансфекцията понякога може да бъде предизвикателна и има няколко често срещани проблема, които могат да възникнат. Ето няколко съвета за отстраняване на неизправности за често срещани проблеми с трансфекцията:
Ниска ефективност на трансфекцията
- Проверете качеството и количеството на нуклеиновата киселина. Уверете се, че нуклеиновата киселина е чиста и с високо качество.
- Оптимизирайте условията на трансфекция, като концентрация на реагент на трансфекцията, съотношение на нуклеинова киселина към реагент и време на инкубация.
- Проверете здравето и жизнеспособността на клетките. Уверете се, че клетките са здрави и активно растат преди трансфекцията.
- Опитайте различен метод на трансфекция или реагент.
Клетъчна токсичност
- Намаляване на концентрацията на трансфекционния реагент или нуклеиновата киселина.
- Оптимизирайте условията на трансфекция, за да се сведе до минимум увреждането на клетките.
- Използвайте различен метод на трансфекция или реагент, който е по -малко токсичен за клетките.
Ефективност на променлива трансфекция
- Уверете се, че клетките се засяват равномерно и при подходящата плътност.
- Смесете добре трансфекционния комплекс, преди да го добавите към клетките.
- Инкубирайте клетките при последователни условия, за да се сведе до минимум променливостта.
Заключение
Трансфектирането на TET-213 клетки може да бъде предизвикателен, но възнаграждаващ процес. Избирайки правилния метод на трансфекция, подготовката на клетките правилно и следвайки подходящия протокол, можете да постигнете висока ефективност на трансфекция и да получите надеждни резултати. Ако имате някакви въпроси или се нуждаете от допълнителна помощ с Tet-213 клетъчна трансфекция, моля, не се колебайте да се свържете с нас. Ние сме водещ доставчик на Tet-213 клетки и можем да ви осигурим висококачествени клетки, трансфекционни реагенти и техническа поддръжка.
В допълнение към клетките Tet-213, ние предлагаме и широк спектър от пептиди, включителноГаланан (човек),Цикло (RGDFC)иДинорфин А (1-13), амид, свински. Тези пептиди могат да се използват в различни изследователски приложения, като невронаука, изследване на рака и откриване на лекарства.
Ако се интересувате от закупуване на Tet-213 клетки или някое от нашите пептиди, моля, свържете се с нас, за да обсъдим вашите специфични нужди. Очакваме с нетърпение да работим с вас и да ви помогнем да постигнете своите изследователски цели.
ЛИТЕРАТУРА
- Sambrook, J., & Russell, DW (2001). Молекулярно клониране: лабораторен наръчник. Лабораторна преса на Cold Spring Harbour.
- Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, Re, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA, & Struhl, K. (ред.). (2002). Текущи протоколи в молекулярната биология. John Wiley & Sons.
- Chen, C., & Okyama, H. (1987). Високоефективна трансформация на клетки на бозайници чрез плазмидна ДНК. Молекулярна и клетъчна биология, 7 (8), 2745-2752.
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., & Hofschneider, Ph (1982). Трансфер на гени в миши лиомни клетки чрез електропорация във високи електрически полета. Embo Journal, 1 (7), 841-845.
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, Fh, ... & Verma, IM (1996). Доставяне на ген in vivo и стабилна трансдукция на неидивиращи клетки от лентивирусен вектор. Science, 272 (5259), 263-267.